Desarrollo de un método molecular alternativo para la detección de Listeria monocytogenes. Aplicación en muestras de queso.

Abstract

Listeria monocytogenes es capaz de sobrevivir y crecer en condiciones de refrigeración. Los alimentos se pueden contaminar en cualquier eslabón de la cadena productiva. El método microbiológico (ISO 11290-1:2017) de referencia requiere 10 días para identificar la especie. El objetivo de este trabajo fue desarrollar y validar un método molecular para la detección de L. monocytogenes en muestras de quesos blandos. Se diseñó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) anidada para la amplificación de una secuencia del gen HlyA que codifica para la listeriolisina O, factor de patogenicidad. Un control interno de amplificación (CIA) fue diseñado para evaluar la presencia de inhibidores de la polimerasa y un control de ADN plasmídico, con un fragmento del gen HlyA, fue generado para determinar el límite de detección (LD), reproducibilidad y repetibilidad de la PCR anidada. La validación se realizó con muestras obtenidas a distintos tiempos de cultivos contaminados artificialmente con L. monocytogenes (0; 3,4; 34 y 340 ufc/25 g) por el método microbiológico de referencia. Finalmente, se analizaron 80 muestras de quesos blandos comerciales. La utilización de 100.000 copias por reacción del CIA no interfiere con la amplificación del ADN molde. El LD de la PCR anidada fue de 30 copias por reacción con 100% de repetibilidad y reproducibilidad. La muestra óptima para la realización de la PCR anidada fue la obtenida luego de 24 h de cultivo en Caldo Fraser. En estas condiciones, la concentración más baja ensayada (3,4 ufc/25 g) fue detectada en las 3 muestras analizadas. Todas las muestras de quesos comerciales fueron negativas para L. monocytogenes tanto por PCR anidada como por el método microbiológico convencional. Estos resultados demuestran que la PCR anidada desarrollada es una herramienta robusta, específica y altamente sensible para la detección de L. monocytogenes en alimentos, con potencial aplicación en controles de calidad microbiológica en la industria alimentaria.